https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/18818
File | Description | Size | Format | |
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evamariadeassiscarvalho.pdf | PDF/A | 15.39 MB | Adobe PDF | ![]() View/Open |
Type: | Dissertação |
Title: | Padronização e validação de técnica de qPCR para detecção dos HPVs de alto risco 16 e 18 em pacientes com doença inflamatória intestinal |
Author: | Carvalho, Eva Maria de Assis |
First Advisor: | Watanabe, Aripuanã Sakurada Aranha |
Referee Member: | Silva, Vania Lúcia da |
Referee Member: | Carraro, Emerson |
Resumo: | Os papilomavírus humanos (Human papillomaviruses-HPVs) são vírus de DNA dupla fita que apresentam grande diversidade genética e causam infecções de pele e mucosa. Alguns tipos do vírus estão ligados a diversos tipos de câncer, como o de colo de útero e do canal anal, sendo os tipos 16 e 18 os mais comuns. Porém, dados sobre prevalência da infecção anal por HPV são escassos, e são ainda mais escassos dados sobre a infecção anal em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), como a doença de Crohn (DC) e a retocolite ulcerativa (RCU). Essa população pode estar em risco por conta da inflamação constante, resposta imune atípica e a frequente utilização de medicamentos imunossupressores, conhecidamente associados ao surgimento de neoplasias. O que evidencia a importância da detecção do HPV nessa população. A infecção por HPV pode ocorrer mesmo que não haja lesões detectáveis, sendo as técnicas moleculares como a PCR muito úteis na identificação do patógeno e diferenciação de seus tipos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é padronizar uma reação de PCR quantitativa (qPCR) para detecção de HPV 16 e 18, e validar o protocolo em amostras clínicas de pacientes que apresentam DII. Para a padronização, foram testadas variações na concentração dos primers e das sondas, condições da ciclagem térmica, bem como outros parâmetros da reação de qPCR, além de testes in silico dos primers e sondas. Foram utilizadas amostras sabidamente positivas e quantificadas para os tipos 16 e 18 do HPV para construção de uma curva padrão de concentração, a fim de avaliar parâmetros relacionados à performance do ensaio, como a eficiência, sensibilidade e linearidade da reação. Foram testados diferentes kits de extração de DNA comerciais visando selecionar o mais adequado para as amostras utilizadas. Para tanto, o material genético extraído de duas amostras foi quantificado e sua pureza foi avaliada. Após padronizada a reação, foram utilizadas amostras coletadas de 183 pacientes, 133 com DII e 50 pacientes saudáveis (grupo controle) para validação. O melhor resultado na extração do DNA foi obtido com a utilização do kit Qiaamp DNA blood mini kit (Qiagen). Os testes de especificidade mostraram que os primers são específicos para ambos os tipos testados. A sensibilidade da reação para detecção do HPV 16 e do HPV 18 é de até 10 cópias/µL. A eficiência e o r² calculados para a reação de detecção do HPV 16 foi de 92,032 e 0,985, respectivamente. Para a reação de detecção do HPV 18, a eficiência foi de 93,055 e o r² foi de 0,986. Das 183 amostras utilizadas, 9 foram positivas para algum tipo de HPV, sendo 2 do grupo controle e 7 do grupo com DII. Entretanto a diferença entre os dois grupos não foi significativa (p>0,05). Por fim, deve-se ressaltar que é importante gerar mais dados sobre a infecção por HPV nessa população, para que possam ser elaboradas melhores medidas profiláticas e diretrizes de saúde voltadas para essa população. |
Abstract: | The Human papillomaviruses (HPVs) are double-stranded DNA viruses with great genetic diversity cause skin and mucous membrane infections. Some of the virus’ types are linked to several forms of cancer, such as cervical and anal cancers, with the types 16 and 18 being the most common. However, data on the prevalence of anal HPV infection are scarce, and data on anal infection in patients with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease and ulcerative colitis, are even scarcer. This population may be at special risk due to constant inflammation, atypical immune response, and frequent use of immunosuppressive drugs, which are known to be associated with the development of neoplasia. This highlights the importance of detecting HPV in this population. HPV infection can occur even in the absence of detectable lesions, and molecular techniques such as PCR are remarkably useful in identifying the pathogen and differentiating its types. Therefore, the objective of this study is to standardize a quantitative PCR (qPCR) reaction for the detection of HPV 16 and 18, and to validate the protocol in clinical samples from patients with IBD. For standardization, variations in the concentration of primers and probes, thermal cycling conditions, as well as other qPCR parameters were tested, in addition to in silico tests of the primers and probes. Quantified samples known to be positive for HPV types 16 and 18 were used to construct a standard concentration curve in order to evaluate parameters related to the performance of the assay, such as the efficiency, sensitivity and linearity of the reaction. Different commercial DNA extraction kits were tested in order to select the most suitable one for the samples used. To this end, the genetic material extracted from two samples was quantified and assessed for its purity. After the reaction was standardized, samples collected from 183 patients, 133 with IBD and 50 healthy patients (control group) were used for validation. The best DNA extraction result was achieved using the Qiaamp DNA blood mini kit (Quiagen). Specificity tests showed that the primers were specific for both the types tested. The sensitivity of the reaction for detecting HPV 16 and 18 is up to 10 copies/µL. The efficiency and r² calculated for the HPV 16 detection reaction were 92.032 and 0.985, respectively. For the HPV 18 detection reaction, the efficiency was 93.055 and the r² was 0.986. Of the 183 samples used, 9 were positive for some type of HPV, 2 from the control group and 7 from the IBD group. However, the difference between the two groups was not significant (p>0.05). Finally, it should be emphasized that it is important to generate more data on HPV infection in patients with IBD, so that better prophylactic measures and health guidelines can be developed for this population. |
Keywords: | HPV PCR em tempo real Doença inflamatória intestinal Real-time PCR Inflammatory bowel disease |
CNPq: | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS |
Language: | por |
Country: | Brasil |
Publisher: | Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) |
Institution Initials: | UFJF |
Department: | ICB – Instituto de Ciências Biológicas |
Program: | Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia |
Access Type: | Acesso Aberto Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil |
Creative Commons License: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ |
URI: | https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/18818 |
Issue Date: | 25-Apr-2025 |
Appears in Collections: | Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações) |
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